ChromSword -
Il software unico per lo sviluppo di metodi LC per grandi molecole
Lo sviluppo di metodi HPLC per biomolecole di grandi dimensioni (come proteine, mAb, peptidi e oligonucleotidi) è un compito complesso perché queste molecole si comportano in modo molto diverso dalle piccole molecole nei sistemi cromatografici.
Lavorando con il pacchetto ChromSword per le molecole di grandi dimensioni, puoi utilizzare due approcci allo sviluppo dei metodi: assistito dal computer (offline) e automatizzato (online). Puoi combinare lo screening automatizzato delle fasi stazionarie e mobili con l’apprendimento automatico e l’ottimizzazione completamente automatica, oppure la progettazione statistica degli esperimenti con la modellazione della ritenzione e della separazione.
Complessità strutturale
Stati di carica multipli
Miscele complesse ed eterogeneità
Complessità strutturale
Le biomolecole di grandi dimensioni hanno:
- Domini multipli
- Legami disolfuro
- Modifiche post-traduzionali (PTM)
- Conformazioni flessibili
Queste caratteristiche strutturali influenzano il modo in cui la molecola interagisce con la fase stazionaria, rendendo imprevedibili la ritenzione e la separazione.
Le proteine e i peptidi hanno molti gruppi ionizzabili – molteplici stati di carica in diversi intervalli di pH.
Questo significa che:
- La ritenzione può cambiare radicalmente con piccoli aggiustamenti di pH
Queste caratteristiche strutturali influenzano il modo in cui la molecola interagisce con la fase stazionaria, rendendo imprevedibili la ritenzione e la separazione.
Miscele complesse ed eterogeneità
Le biomolecole spesso esistono come
una miscela di varianti:
- Glicogrammi
- Deamidazione, prodotti di ossidazione
- Aggregati, frammenti
Separare queste specie strettamente correlate è molto più complicato che separare le impurità di piccole molecole.
La progettazione statistica degli esperimenti (DoE) per lo sviluppo di metodi HPLC per biomolecole di grandi dimensioni spesso fallisce o fornisce risultati fuorvianti perché le ipotesi alla base della DoE non sono valide per questi analiti complessi.
Il DoE presuppone che le risposte cambino in modo prevedibile (curvatura lineare o almeno quadratica).
Ma per le biomolecole di grandi dimensioni, piccoli cambiamenti nel pH, nella temperatura, nella forza ionica o nel contenuto organico possono causare cambiamenti graduali piuttosto che graduali.
Le proteine possono eluire, attaccarsi, denaturarsi o aggregarsi bruscamente.
- Questo rompe i presupposti del modello DoE e porta a una scarsa capacità predittiva.
Si verificano contemporaneamente più effetti interdipendenti
Per le molecole di grandi dimensioni, la ritenzione in HPLC è determinata da una combinazione di:
- Cambiamenti di conformazione
- Svolgimento/rivolgimento
- Adsorbimento sulle superfici
- Spostamenti di stato di ionizzazione
- Interazioni secondarie con metalli e silice
Le forti interazioni secondarie portano a un comportamento imprevedibile
Le biomolecole spesso interagiscono con i gruppi silanolici di una fase stazionaria; tuttavia, queste interazioni non fanno parte dello spazio di progettazione e possono modificare in modo imprevedibile la ritenzione.
I modelli tipici del DoE:
- Effetti principali
- Interazioni a due fattori
- Curvatura quadratica
Ma le separazioni di biomolecole si manifestano comunemente:
- Interazioni a tre e quattro fattori
- Interazioni temperatura × pH × forma del gradiente × forza ionica
I disegni DoE standard non sono in grado di cogliere questi effetti.
L’eterogeneità delle biomolecole aggiunge variabili nascoste
Le proteine esistono come miscele:
- Glicogrammi
- Varianti di carica
- Frammenti
- Aggregati
- Specie di ossidazione/deamidazione
Ogni specie spesso risponde in modo diverso alle variazioni delle condizioni cromatografiche. Il DoE presuppone che un singolo analita risponda in modo coerente, ma la stessa molecola può avere molte specie con comportamenti cromatografici diversi.
Gli algoritmi di sviluppo automatico dei metodi di ChromSword per le biomolecole di grandi dimensioni applicano un motore di ottimizzazione iterativo, adattivo e guidato dai meccanismi piuttosto che una modalità di risposta predefinita ai fattori.
ChromSword utilizza l’apprendimento adattivo in tempo reale, non un design statico.
Il DoE classico richiede una predefinizione:
- quali fattori variare
- gli intervalli
- la forma del modello (di solito lineare o quadratico)
Ma le biomolecole di grandi dimensioni presentano un comportamento non lineare, con bruschi cambiamenti nella ritenzione, nella forma dei picchi o nella selettività.
ChromSword invece:
- Esegue un esperimento
- Legge il cromatogramma
- Regola automaticamente le condizioni utilizzando l’apprendimento basato sui dati, il ragionamento simbolico e l’intelligenza computazionale.
Questo sistema adattativo ad anello chiuso gestisce un comportamento non lineare e imprevedibile molto meglio delle griglie DoE fisse.
ChromSword ottimizza i gradienti non lineari, che sono fondamentali per le molecole di grandi dimensioni
ChromSword automaticamente:
- progetta gradienti a gradini
- applica la curvatura
- regola i tempi di attesa
- distribuisce i segmenti di pendenza in modo intelligente
DoE non è in grado di gestire forme di gradiente arbitrarie. Gli esseri umani impiegano giorni o settimane per ottimizzarle. ChromSword lo fa automaticamente.
ChromSword lavora direttamente con il comportamento cromatografico grezzo, non con le ipotesi.
Il DoE cerca di correlare i fattori → le risposte (come Rs), ma per le molecole di grandi dimensioni:
- Rs è rumoroso
- L’integrazione varia
- Le posizioni dei picchi si spostano in modo non lineare, il che porta a massimi e minimi netti nei grafici di risoluzione.
ChromSword invece:
- Valuta il movimento e la forma del picco in modo qualitativo
- Analizza i derivati dei profili cromatografici
- Stima la capacità di picco e la selettività senza fare affidamento su
- Sugli integrali rumorosi
- Prende decisioni basate sulla fisica cromatografica, non su presupposti statistici.
Questo lo rende molto più affidabile per le biomolecole.
Infine, ChromSword può eseguire una progettazione statistica degli esperimenti per identificare le condizioni ben ottimizzate per migliorare un metodo e per testarne la robustezza.
Sfida nelle grandi molecole
- Ritenzione non lineare e imprevedibile
- Famiglie e spalle di picco complesse
- Necessità di gradienti sagomati.
- Spazio dei parametri ampio e multidimensionale
- Integrazione rumorosa
- Sperimentazione lenta
Perché ChromSword ha successo
- Algoritmo adattivo e iterativo
- Algoritmi avanzati di riconoscimento dei picchi
- Progettazione automatica del gradiente non lineare
- Ampia scansione intelligente
- Utilizza il comportamento cromatografico grezzo, non i soli R numerici
- Esplorazione completamente automatizzata