ChromSword -
Le logiciel unique pour le développement de méthodes LC pour les grandes molécules
La mise au point de méthodes CLHP pour les grandes biomolécules (telles que les protéines, les AcM, les peptides et les oligonucléotides) est une tâche complexe, car ces molécules se comportent très différemment des petites molécules dans les systèmes chromatographiques.
En travaillant avec le progiciel ChromSword pour les grandes molécules, vous pouvez utiliser deux approches de développement de méthodes : assistée par ordinateur (hors ligne) et automatisée (en ligne). Vous pouvez combiner le criblage automatisé des phases stationnaires et mobiles avec l’apprentissage automatique et l’optimisation entièrement automatique, ou les plans d’expériences statistiques avec la modélisation de la rétention et de la séparation.
Complexité structurelle
États de charge multiples
Mélanges complexes et hétérogénéité
Complexité structurelle
Les grandes biomolécules ont :
- Domaines multiples
- Liaisons disulfures
- Modifications post-traductionnelles (PTM)
- Conformations flexibles
Ces caractéristiques structurelles affectent la manière dont la molécule interagit avec la phase stationnaire, ce qui rend la rétention et la séparation imprévisibles.
Les protéines et les peptides comportent de nombreux groupes ionisables, c’est-à-dire plusieurs états de charge dans les différentes plages de pH.
Cela signifie que :
- La rétention peut changer radicalement avec de petits ajustements du pH.
Ces caractéristiques structurelles affectent la manière dont la molécule interagit avec la phase stationnaire, ce qui rend la rétention et la séparation imprévisibles.
Mélanges complexes et hétérogénéité
Les biomolécules existent souvent sous la forme
un mélange de variantes :
- Glycoformes
- Désamidation, produits d’oxydation
- Agrégats, fragments
La séparation de ces espèces étroitement liées est beaucoup plus compliquée que la séparation des impuretés de petites molécules.
Les plans d’expériences statistiques (DoE) pour le développement de méthodes HPLC pour les grandes biomolécules échouent souvent ou donnent des résultats trompeurs parce que les hypothèses sous-jacentes des DoE ne sont pas valables pour ces analytes complexes.
Le DoE part du principe que les réponses évoluent de manière prévisible (courbure linéaire ou au moins quadratique).
Mais pour les grandes biomolécules, de petites modifications du pH, de la température, de la force ionique ou de la teneur en matières organiques peuvent entraîner des changements progressifs plutôt que graduels.
Les protéines peuvent éluer, coller, se dénaturer ou s’agréger brusquement.
- Cela rompt les hypothèses du modèle DoE et conduit à une faible capacité de prédiction.
Des effets multiples et interdépendants se produisent simultanément
Pour les grandes molécules, la rétention HPLC est déterminée par une combinaison de facteurs :
- Changements de conformation
- Dépliage/repliage
- Adsorption sur les surfaces
- Déplacements d’états d’ionisation
- Interactions secondaires avec les métaux et la silice
Les interactions secondaires fortes entraînent un comportement imprévisible
Les biomolécules interagissent souvent avec les groupes silanols d’une phase stationnaire ; cependant, ces interactions ne font pas partie de l’espace de conception et peuvent modifier la rétention de manière imprévisible.
Le ministère de l’environnement établit généralement des modèles :
- Principaux effets
- Interactions à deux facteurs
- Courbure quadratique
Mais les séparations de biomolécules montrent souvent :
- Interactions à trois et quatre facteurs
- Interactions température × pH × forme du gradient × force ionique
Les conceptions standard de la DoE ne peuvent pas tenir compte de ces effets.
L’hétérogénéité des biomolécules ajoute des variables cachées
Les protéines existent sous forme de mélanges :
- Glycoformes
- Variantes d’accusation
- Fragments
- Agrégats
- Espèces d’oxydation/désamidation
Chaque espèce réagit souvent différemment aux changements de conditions chromatographiques. La DoE part du principe qu’un seul analyte réagit de manière cohérente, mais la même molécule peut avoir de nombreuses espèces ayant des comportements chromatographiques différents.
Les algorithmes de développement de méthodes automatisées de ChromSword pour les grandes biomolécules utilisent un moteur d’optimisation itératif, adaptatif et axé sur les mécanismes plutôt qu’un mode prédéfini de réponse aux facteurs.
ChromSword utilise l’apprentissage adaptatif en temps réel, et non une conception statique.
La DoE classique vous oblige à prédéfinir :
- les facteurs à faire varier
- les gammes
- la forme du modèle (généralement linéaire ou quadratique)
Mais les grandes biomolécules présentent un comportement non linéaire, avec des changements brusques dans la rétention, la forme des pics ou la sélectivité.
ChromSword à la place :
- Réalisation d’une expérience
- Lecture du chromatogramme
- Ajuste automatiquement les conditions en utilisant l’apprentissage basé sur les données, le raisonnement symbolique et l’intelligence informatique.
Ce système adaptatif en boucle fermée gère les comportements non linéaires et imprévisibles bien mieux que les grilles DoE fixes.
ChromSword optimise les gradients non linéaires, qui sont essentiels pour les grandes molécules.
ChromSword automatiquement :
- designs step gradients
- applique la courbure
- ajuste les temps de maintien
- distribue intelligemment les segments de gradient
DoE ne peut pas gérer des formes de gradients arbitraires. Les humains mettent des jours ou des semaines à les optimiser. ChromSword le fait automatiquement.
ChromSword travaille directement avec le comportement chromatographique brut, et non avec des hypothèses.
Le ministère de l’environnement tente d’établir une corrélation entre les facteurs et les réponses (comme Rs), mais pour les grosses molécules :
- Rs est bruyant
- L’intégration varie
- Les positions des pics se déplacent de manière non linéaire, ce qui entraîne des maxima et des minima marqués dans les diagrammes de résolution.
ChromSword à la place :
- Évalue qualitativement le mouvement et la forme des crêtes
- Analyse des dérivés de profils chromatographiques
- Estimation de la capacité maximale et de la sélectivité sans s’appuyer sur les données de la base de données.
- Sur les intégrales bruyantes
- Prend des décisions basées sur la physique chromatographique et non sur des hypothèses statistiques.
Il est donc beaucoup plus fiable pour les biomolécules.
Enfin, ChromSword peut exécuter des plans d’expériences statistiques afin d’identifier les conditions optimales pour améliorer une méthode et tester sa robustesse.
Le défi des grandes molécules
- Rétention non linéaire et imprévisible
- Familles de pics complexes et épaules
- Nécessité d’avoir des dégradés de formes.
- Espace de paramètres large et multidimensionnel
- Intégration bruyante
- Expérimentation lente
Les raisons du succès de ChromSword
- Algorithme adaptatif et itératif
- Algorithmes avancés de reconnaissance des pics
- Conception automatique de gradients non linéaires
- Balayage intelligent à grande échelle
- Utilise le comportement chromatographique brut, et non les R numériques seuls
- Exploration entièrement automatisée