ChromSword -
Die einzigartige Software für die Entwicklung von LC-Methoden für große Moleküle
Die Entwicklung von HPLC-Methoden für große Biomoleküle (wie Proteine, mAbs, Peptide und Oligonukleotide) ist eine komplexe Aufgabe, da sich diese Moleküle in chromatographischen Systemen ganz anders verhalten als kleine Moleküle.
Wenn Sie mit dem ChromSword-Paket für große Moleküle arbeiten, können Sie zwei Ansätze für die Methodenentwicklung verwenden: computergestützt (offline) und automatisiert (online). Sie können das automatische Screening stationärer und mobiler Phasen mit maschinellem Lernen und vollautomatischer Optimierung oder statistischer Versuchsplanung mit Retentions- und Trennungsmodellierung kombinieren.
Strukturelle Komplexität
Mehrere Ladungszustände
Komplexe Mischungen und Heterogenität
Strukturelle Komplexität
Große Biomoleküle haben:
- Mehrere Domänen
- Disulfid-Bindungen
- Posttranslationale Modifikationen (PTMs)
- Flexible Konformationen
Diese strukturellen Merkmale wirken sich darauf aus, wie das Molekül mit der stationären Phase interagiert, wodurch Retention und Trennung unvorhersehbar werden.
Proteine und Peptide haben viele ionisierbare Gruppen – mehrere Ladungszustände in verschiedenen pH-Bereichen.
Dies bedeutet:
- Die Retention kann sich durch kleine pH-Anpassungen dramatisch verändern
Diese strukturellen Merkmale wirken sich darauf aus, wie das Molekül mit der stationären Phase interagiert, wodurch Retention und Trennung unvorhersehbar werden.
Komplexe Mischungen und Heterogenität
Biomoleküle existieren oft als
eine Mischung von Varianten:
- Glykoformen
- Deamidierung, Oxidationsprodukte
- Aggregate, Fragmente
Die Trennung dieser eng verwandten Spezies ist viel komplizierter als die Trennung von kleinmolekularen Verunreinigungen.
Die statistische Versuchsplanung (DoE) für die Entwicklung von HPLC-Methoden für große Biomoleküle schlägt oft fehl oder führt zu irreführenden Ergebnissen, da die zugrunde liegenden Annahmen der DoE für diese komplexen Analyten nicht gelten.
DoE geht davon aus, dass sich die Antworten auf vorhersehbare Weise ändern (lineare oder zumindest quadratische Krümmung).
Aber bei großen Biomolekülen können kleine Änderungen des pH-Werts, der Temperatur, der Ionenstärke oder des organischen Gehalts eher zu sprunghaften als zu allmählichen Veränderungen führen.
Proteine können eluieren, verkleben, denaturieren oder abrupt aggregieren.
- Dies bricht die Annahmen des DoE-Modells und führt zu einer schlechten Vorhersagekraft.
Mehrere voneinander abhängige Effekte treten gleichzeitig auf
Bei großen Molekülen wird die HPLC-Retention durch eine Kombination aus:
- Änderungen der Konformation
- Entfalten/Neufalten
- Adsorption an Oberflächen
- Ionisationszustandsverschiebungen
- Sekundäre Wechselwirkungen mit Metallen und Siliziumdioxid
Starke sekundäre Wechselwirkungen führen zu unvorhersehbarem Verhalten
Biomoleküle interagieren häufig mit den Silanolgruppen einer stationären Phase. Diese Interaktionen sind jedoch nicht Teil des Designraums und können die Retention auf unvorhersehbare Weise verändern.
DoE typischerweise Modelle:
- Wichtigste Auswirkungen
- Zwei-Faktor-Interaktionen
- Quadratische Krümmung
Aber die Trennung von Biomolekülen ist üblich:
- Drei- und Vier-Faktoren-Interaktionen
- Wechselwirkungen zwischen Temperatur × pH-Wert × Gradientenform × Ionenstärke
Standard DoE-Designs können diese Effekte nicht erfassen.
Heterogenität von Biomolekülen fügt versteckte Variablen hinzu
Proteine existieren als Mischungen:
- Glykoformen
- Varianten der Ladung
- Fragmente
- Aggregate
- Oxidations-/Deamidierungsarten
Jede Spezies reagiert oft unterschiedlich auf Änderungen der chromatographischen Bedingungen. DoE geht davon aus, dass ein einziger Analyt einheitlich reagiert, aber dasselbe Molekül kann viele Spezies mit unterschiedlichem chromatographischen Verhalten aufweisen.
Die automatisierten Algorithmen von ChromSword zur Entwicklung von Methoden für große Biomoleküle verwenden eine mechanismusgesteuerte, adaptive und iterative Optimierungs-Engine anstelle eines vordefinierten Faktor-Reaktions-Modus.
ChromSword verwendet adaptives Lernen in Echtzeit, kein statisches Design
Bei der klassischen DoE müssen Sie eine Vordefinition vornehmen:
- welche Faktoren zu variieren sind
- die Bereiche
- die Modellform (normalerweise linear oder quadratisch)
Große Biomoleküle zeigen jedoch ein nichtlineares Verhalten mit abrupten Änderungen der Retention, Peakform oder Selektivität.
ChromSword stattdessen:
- Führt ein Experiment durch
- Liest das Chromatogramm
- Passt die Bedingungen automatisch an, indem es datengesteuertes Lernen, symbolisches Denken und computergestützte Intelligenz einsetzt.
Dieses adaptive System mit geschlossenem Regelkreis kann mit nichtlinearem, unvorhersehbarem Verhalten viel besser umgehen als feste DoE-Gitter.
ChromSword optimiert die nichtlinearen Gradienten, die für große Moleküle entscheidend sind
ChromSword automatisch:
- entwirft Stufenverläufe
- wendet die Krümmung an
- passt die Haltezeiten an
- Verteilt Gradientensegmente auf intelligente Weise
DoE kann nicht mit willkürlichen Gradientenformen umgehen. Menschen brauchen Tage oder Wochen, um sie zu optimieren. ChromSword macht das automatisch.
ChromSword arbeitet direkt mit dem rohen chromatographischen Verhalten, nicht mit Annahmen
DoE versucht, Faktoren → Reaktionen (wie Rs) zu korrelieren, allerdings für große Moleküle:
- Rs ist verrauscht
- Integration variiert
- Peak-Positionen verschieben sich auf nichtlineare Weise, was zu scharfen Maxima und Minima in Auflösungsdiagrammen führt
ChromSword stattdessen:
- Bewertet Bewegung und Form der Spitze qualitativ
- Analysiert Ableitungen von chromatographischen Profilen
- Schätzt die Spitzenkapazität und Selektivität, ohne sich auf
- Über verrauschte Integrale
- Trifft Entscheidungen auf der Grundlage der chromatographischen Physik, nicht auf der Grundlage statistischer Annahmen
Das macht es für Biomoleküle viel zuverlässiger.
Schließlich kann ChromSword eine statistische Versuchsplanung durchführen, um optimale Bedingungen für die Verbesserung einer Methode zu ermitteln und ihre Robustheit zu testen.
Herausforderung bei großen Molekülen
- Nichtlineare, unvorhersehbare Speicherung
- Komplexe Spitzenfamilien und Schultern
- Bedarf an geformten Farbverläufen.
- Großer, mehrdimensionaler Parameterraum
- Verrauschte Integration
- Langsames Experimentieren
Warum ChromSword erfolgreich ist
- Adaptiver, iterativer Algorithmus
- Fortgeschrittene Algorithmen zur Erkennung von Peaks
- Automatischer nichtlinearer Gradientenentwurf
- Umfassendes intelligentes Scannen
- Verwendet rohes chromatographisches Verhalten, nicht nur numerische Rs
- Vollständig automatisierte Erkundung