ChromSword -
El software único para el desarrollo de métodos de LC de moléculas grandes
Desarrollar métodos de HPLC para biomoléculas grandes (como proteínas, mAbs, péptidos y oligonucleótidos) es una tarea compleja porque estas moléculas se comportan de forma muy diferente a las moléculas pequeñas en los sistemas cromatográficos.
Trabajando con el paquete ChromSword para moléculas grandes, puedes utilizar dos enfoques de desarrollo de métodos: asistido por ordenador (offline) y automatizado (online). Puedes combinar el cribado automatizado de fases estacionarias y móviles con el aprendizaje automático y la optimización totalmente automática, o el diseño estadístico de experimentos con la modelización de la retención y la separación.
Complejidad estructural
Múltiples estados de carga
Mezclas complejas y heterogeneidad
Complejidad estructural
Las biomoléculas grandes tienen:
- Múltiples dominios
- Enlaces disulfuro
- Modificaciones postraduccionales (PTM)
- Conformaciones flexibles
Estas características estructurales afectan al modo en que la molécula interactúa con la fase estacionaria, haciendo que la retención y la separación sean impredecibles.
Las proteínas y los péptidos tienen muchos grupos ionizables: múltiples estados de carga en todos los rangos de pH.
Es decir:
- La retención puede cambiar drásticamente con pequeños ajustes del pH
Estas características estructurales afectan al modo en que la molécula interactúa con la fase estacionaria, haciendo que la retención y la separación sean impredecibles.
Mezclas complejas y heterogeneidad
Las biomoléculas existen a menudo como
una mezcla de variantes:
- Glicoformas
- Desamidación, productos de oxidación
- Agregados, fragmentos
Separar estas especies estrechamente relacionadas es mucho más complicado que separar las impurezas de moléculas pequeñas.
El Diseño Estadístico de Experimentos (DdE) para el desarrollo de métodos de HPLC de grandes biomoléculas a menudo fracasa o da resultados engañosos porque las suposiciones subyacentes del DdE no se cumplen para estos analitos complejos.
La DoE asume que las respuestas cambian de forma predecible (curvatura lineal o al menos cuadrática).
Pero en el caso de biomoléculas grandes, pequeños cambios en el pH, la temperatura, la fuerza iónica o el contenido orgánico pueden provocar cambios escalonados en lugar de graduales.
Las proteínas pueden eluir, pegarse, desnaturalizarse o agregarse bruscamente.
- Esto rompe los supuestos del modelo DoE y da lugar a un escaso poder predictivo.
Se producen simultáneamente múltiples efectos interdependientes
Para las moléculas grandes, la retención por HPLC viene determinada por una combinación de:
- Cambios de conformación
- Desplegar/replegar
- Adsorción a superficies
- Cambios de estado de ionización
- Interacciones secundarias con metales y sílice
Las fuertes interacciones secundarias provocan un comportamiento impredecible
Las biomoléculas suelen interactuar con los grupos silanol de una fase estacionaria; sin embargo, estas interacciones no forman parte del espacio de diseño y pueden modificar la retención de forma impredecible.
Los modelos típicos del DoE:
- Efectos principales
- Interacciones de dos factores
- Curvatura cuadrática
Pero las separaciones de biomoléculas suelen mostrar:
- Interacciones de tres y cuatro factores
- Interacciones temperatura × pH × forma del gradiente × fuerza iónica
Los diseños DoE estándar no pueden captar estos efectos.
La heterogeneidad de las biomoléculas añade variables ocultas
Las proteínas existen como mezclas:
- Glicoformas
- Variantes de carga
- Fragmentos
- Áridos
- Especies de oxidación/desamidación
Cada especie suele responder de forma diferente a los cambios en las condiciones cromatográficas. La DoE supone que un único analito responde de forma coherente, pero la misma molécula puede tener muchas especies con comportamientos cromatográficos diferentes.
Los algoritmos automatizados de desarrollo de métodos de ChromSword para grandes biomoléculas aplican un motor de optimización iterativo, adaptativo e impulsado por mecanismos, en lugar de un modo predefinido de factor-respuesta.
ChromSword utiliza el aprendizaje adaptativo en tiempo real, no un diseño estático
La DoE clásica requiere que definas previamente:
- qué factores variar
- las gamas
- la forma del modelo (normalmente lineal o cuadrática)
Pero las biomoléculas grandes presentan un comportamiento no lineal, con cambios bruscos en la retención, la forma del pico o la selectividad.
ChromSword en su lugar:
- Realiza un experimento
- Lee el cromatograma
- Ajusta automáticamente las condiciones utilizando el aprendizaje basado en datos, el razonamiento simbólico y la inteligencia computacional.
Este sistema adaptativo de bucle cerrado maneja el comportamiento no lineal e impredecible mucho mejor que las rejillas DoE fijas.
ChromSword optimiza los gradientes no lineales, que son críticos para las moléculas grandes
ChromSword automáticamente:
- diseña degradados escalonados
- aplica la curvatura
- ajusta los tiempos de espera
- distribuye los segmentos de gradiente de forma inteligente
DoE no puede manejar formas de gradiente arbitrarias. Los humanos tardan días o semanas en optimizarlas. ChromSword lo hace automáticamente.
ChromSword trabaja directamente con el comportamiento cromatográfico en bruto, no con suposiciones
DoE intenta correlacionar factores → respuestas (como Rs), pero para moléculas grandes:
- Rs es ruidoso
- La integración varía
- Las posiciones de los picos se desplazan de forma no lineal, lo que da lugar a máximos y mínimos pronunciados en los gráficos de resolución
ChromSword en su lugar:
- Evalúa cualitativamente el movimiento y la forma del pico
- Analiza los derivados de los perfiles cromatográficos
- Estima la capacidad máxima y la selectividad sin depender
- Sobre las integrales ruidosas
- Toma decisiones basadas en la física cromatográfica, no en suposiciones estadísticas
Esto la hace mucho más fiable para las biomoléculas.
Por último, ChromSword puede ejecutar el diseño estadístico de experimentos para identificar las condiciones bien optimizadas para mejorar un método y comprobar su robustez.
El reto de las moléculas grandes
- Retención no lineal e imprevisible
- Familias de picos y hombros complejos
- Necesidad de degradados con forma.
- Espacio de parámetros amplio y multidimensional
- Integración ruidosa
- Experimentación lenta
Por qué triunfa ChromSword
- Algoritmo adaptativo e iterativo
- Algoritmos avanzados de reconocimiento de picos
- Diseño automático de gradiente no lineal
- Escaneado inteligente amplio
- Utiliza el comportamiento cromatográfico bruto, no sólo las R numéricas
- Exploración totalmente automatizada